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Iluminando Insights en luciferasa de luciérnaga y Otros reporteros bioluminiscentes usados ​​en Biología Química Natasha Thorne 1 James Inglese 1 Douglas S. Auld 1 ,. 1 NIH Centro de Química Genómica, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD 20892-3370, EE. UU. Disponible en Internet el 24 junio de 2010. La comprensión de enzimología luciferasa y la estructura de los compuestos que modulan la actividad de la luciferasa se puede utilizar para mejorar el diseño de los ensayos basados ​​en la luminiscencia. Esta revisión proporciona una visión general de estos reporteros populares con énfasis en la luciferasa de luciérnaga usado comúnmente de Photinus pyralis (Fluc). estudios de perfil de química a gran escala han identificado una variedad de andamios que inhiben Fluc. En algunos ensayos basados ​​en células, estos inhibidores pueden actuar de una manera contraria a la intuición, dando lugar a una ganancia en la señal luminiscente. Aunque anteriormente atribuido a la activación transcripcional, la estabilización intracelular de Fluc es el principal mecanismo que subyace a esta observación. inhibición Fluc y estabilización pueden ser complejos, como se ilustra por el compuesto PTC124, que se convierte por Fluc en presencia de ATP a una alta afinidad inhibidor de aducto multisustrato, PTC124-AMP. La influencia potencial de estos hallazgos pueden tener en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos se proporciona aquí. Gráficamente abstracto Palabras clave Texto principal Introducción Los avances técnicos en la biología molecular, espectrofotometría a base de placa de microtitulación, y la automatización han permitido el desarrollo de ensayos biológicos relevantes con un rendimiento robusto que se pueden utilizar en el cribado de alto rendimiento (HTS) para aplicaciones de biología química y de descubrimiento de fármacos. Estos ensayos sofisticados, que se caracteriza por su capacidad para ser traducidos de la banca para totalmente automatizado sistemas HTS manteniendo al mismo tiempo la sensibilidad, la intensidad de la señal, y la fidelidad biológica, a menudo implican la captura de una respuesta biológica utilizando un único reportero que tiene una salida basada en la luz. A pesar de tales ensayos mejoran en gran medida nuestra capacidad para monitorear los procesos biológicos complejos, la incorporación de un reportero biológico puede influir en los resultados del ensayo en formas no previstas y no previstas. La comprensión de estas complejidades relacionadas reportero-es esencial, y los ensayos de seguimiento adecuadas debe estar dirigido a la identificación de los artefactos relacionados reportero-con el fin de validar el HTS resultado, así como proporcionar una correcta interpretación de las relaciones estructura-actividad (SAR) derivado durante el posterior sonda / esfuerzos de optimización de plomo. La bioluminiscencia es una tecnología de detección utilizada comúnmente explotadas a través de la academia y la industria. Un indicador de esto se evidencia por los cerca de 2.000 ensayos que figuran actualmente en la base de datos PubChem: aproximadamente el 21% son bioluminiscencia y el 53% son de fluorescencia, y el resto mediante otros formatos de ensayo, tales como absorbancia (Figura 1) (véase la revisión de Inglese et al. 2007 para una visión general de los diferentes formatos de ensayo HTS). ensayos bioluminiscentes se basan en enzimas luciferasa, que catalizan la oxidación de sustratos específicos conocidos como luciferinas para formar oxiluciferina, con la emisión concomitante de un fotón. A pesar de todas las luciferasas catalizan reacciones emisores de luz, los sustratos luciferina son estructuralmente diversa. Luciferasas de muchos organismos de bioluminiscencia productoras se han clonado y aislado con el propósito de construir sistemas de bioensayo (Fan y Wood, 2007 y Hoshino, 2009), incluyendo las luciferasas de luciérnagas (Lampyridae), elateridae (elateridae), las larvas de ciertos escarabajos conocido como luciérnagas (Phengodidae), y diversos organismos marinos como el pensamiento de mar (Renillidae). Figura 1. Análisis por tipo de detección PubChem Actualmente, de los & gt; 2000 ensayos enumerados en PubChem, bioluminiscencia y fluorescencia representan las dos estrategias de detección más prominentes. NCI es el ensayo de viabilidad celular del panel NCI-60. Esta revisión proporciona un resumen de las luciferasas de uso común y sugiere recomendaciones para su uso apropiado en los ensayos de HTS comunes. Un enfoque particular que se coloca sobre la luciferasa de luciérnaga ampliamente utilizado, Fluc. Todos los formatos de ensayo, incluidas las destinadas a Fluc, han asociado artefactos que interfieren con la interpretación de los resultados del ensayo. Por esta razón, vamos a describir nuestros esfuerzos para aplicar el cribado basado en la titulación (HTS cuantitativos [qHTS]) para identificar, clasificar y entender el comportamiento de los compuestos que interactúan con Fluc en ensayos bioquímicos y basados ​​en células. Los compuestos que interfieren con la detección Fluc son predominantemente inhibidores de la enzima pero varían en su modo de acción, de inhibidores competitivos simples a los inhibidores únicos aducto multisustrato, como se ilustra por PTC124 (Ataluren). Aquí se describen las complejidades asociadas con la enzimología reportero y cómo esto puede influir en los esfuerzos de descubrimiento de compuestos. Visión general de luciferasas y Usos en HTS Las luciferasas utilizadas en HTS se pueden dividir en varios grupos principales de acuerdo a su sustrato y cofactor dependencia y en función de si la enzima se expresa intracelularmente o se secreta a partir de células (Tabla 1; véase la Tabla S1 disponible en línea). Además, algunos luciferasas se utilizan para los ensayos de HTS o bien por células o basado en bioquímicos, mientras que otros se han desarrollado para el uso en formatos de ensayo (Tabla 1). Una de las principales razones para el uso generalizado de la luciferasa en bioensayos es que, a diferencia de la fluorescencia, luminiscencia no requiere energía de la luz de excitación, lo que disminuye la señal de fondo para proporcionar un ensayo sensible con una elevada relación señal-fondo. Eliminación de una fuente de luz de excitación también impide la interferencia de la fluorescencia compuesto (Simeonov et al., 2008) y photobleaching fluoróforo. Por lo tanto, los ensayos de luminiscencia pueden ser muy sensibles, a pesar de una intensidad de señal significativamente más débil que la fluorescencia. Para los ensayos basados ​​en células, el uso de Fluc o luciferasa de Renilla (Rluc) enzimas como la prensa permite la medición de los cambios dinámicos en los niveles de reportero de transcripción porque la proteína intracelular vidas medias de estas enzimas luciferasa son relativamente cortos en comparación con la prensa de proteínas fluorescentes no enzimáticos tales como GFP (proteína de vida media, 26 h; Corish y Tyler-Smith, 1999). En comparación, la proteína vidas medias de Gaussia luciferasa (gluc) (Wurdinger et al. 2008) y Cypridina luciferina 2-monooxigenasa (Cluc) (Nakajima et al. 2004), una vez secretado, son significativamente más largos que los de cualquiera de Fluc o Rluc (6 días y 53 horas, respectivamente, en los medios de cultivo celular, Tabla 1), aunque, en este momento, ni tampoco gluc Cluc se utiliza comúnmente en HTS. Tabla 1. Las luciferasas químicos utilizados en aplicaciones de biología B, formato de ensayo bioquímico; C, el formato de ensayo basado en células; N / A, no aplicable. La luciferasa no se utiliza actualmente en formatos basados ​​en células. Estos luciferasas actualmente no están ampliamente utilizadas en HTS. La aplicación de Fluc como reportero comenzó a finales de 1980, después de su clonación inicial (de Wet et al., 1985), y la expresión en células de mamíferos (de Wet et al. 1985 y de Wet et al., 1987). La enzima Fluc se encontró que era un reportero sensible para ensayos biológicos (de Wet et al. 1987. Nguyen et al. 1988 y Ow et al. 1986) y catalíticamente activo como monómero (Wood, 1995) y fue optimizada para la expresión y actividad como un gen informador en células de mamífero (Wood, 1998), aunque ahora se usa ampliamente para aplicaciones bioquímicas en HTS también. Una luciferasa de una especie diferente de la luciérnaga, Photuris pennsylvanica. también se ha optimizado y desarrollado para su uso como un reportero (aunque para ensayos bioquímicos solamente) en la base de su utilización de D-luciferina (D-LH 2) y ATP como sustratos (por ejemplo Ultra-Glo) (Fan y Wood, 2007 ). ensayos bioquímicos típicos que utilizan ya sea Fluc o Ultra-Glo incluyen los que miden ATP o concentraciones de ADP (Singh et al. 2004 y Tanega et al. 2009) o utilizar pro-luciferina sustratos para detectar actividad de la proteína diana (Cali et al. 2006 y ventilador y Wood, 2007) (Tabla S1). Rluc, otro indicador de luciferasa de uso común (Roda et al., 2009), no comparte la secuencia de aminoácidos similitud con Fluc (Greer y Szalay, 2002 y Lorenz et al., 1991) y la producción de luz es el ATP independiente (Hart et al. 1979) . Rluc es enzimáticamente activa como un monómero (Matthews et al. 1977), que cataliza la descarboxilación oxidativa de la coelenterazina luciferina a través de un dioxetano intermedio antes de la conversión a coelenteramide, con la emisión simultánea de luz azul (Figura 2 A) (Hart et al. 1978). En comparación con Fluc, Rluc tiene algunas desventajas como un reportero de ensayo, tal como se describe en la Tabla S1. Figura 2. Ensayo de Luciferasa Configuraciones (A) El protocolo de doble ensayo de luciferasa se ilustra. Las células se lisan con un reactivo de detección que contiene sustratos de luciferasa (1), se mide Fluc luminiscencia (2), la reacción Fluc se detiene a continuación, junto con la adición del sustrato coelenterazina para Rluc (3), y la luminiscencia se mide de nuevo (4) . En este caso, la luminiscencia total se midió usando un filtro transparente; los espectros de emisión de luminiscencia de Fluc y Rluc también se muestran (CPS, cuentas por segundo medidos en un luminómetro). se muestra (B) CBLuc de dos colores protocolo de ensayo de doble luciferasa en el que la lisis celular y la detección se llevan a cabo con una adición única de reactivo (1) y la luminiscencia verde y la luminiscencia de color rojo a continuación se miden de forma secuencial en un lector de placa de microtitulación (2), utilizando el los filtros ópticos adecuados. Los máximos de emisión de luminiscencia se observan, y los espectros de emisión de luminiscencia tanto para verde y rojo CBLuc se muestran a continuación. Las líneas de puntos en los espectros de emisión representan los filtros ópticos utilizados en (Davis et al. 2007). (C) una célula viva ensayo cinético se representa el uso de una luciferasa secretada (gluc) que utiliza coelenterazina como sustrato. Cell sobrenadante del cultivo que contiene el secretada gluc se elimina en diferentes momentos (1) y después de mezclar con el sustrato coelenterazina (2) la luminiscencia total para cada punto de tiempo se mide usando un filtro (3, 4, 5, ...). También se muestra los espectros de emisión para gluc en relación con Rluc (espectros adaptado de Tannous et al. 2005). El máximo de emisión de longitud de onda es similar a gluc Rluc, pero gluc muestra la luminiscencia brillante. Las luciferasas Fluc, Rluc, y las variedades rojas o de emisores de luz verde del Caribe clic escarabajo (CBLuc) se han configurado para su uso en ensayos de doble luciferasa. Uno de tales ensayos de doble luciferasa está diseñado de tal manera que la actividad de una luciferasa (típicamente Fluc) pistas con la biología de destino, mientras que el segundo de la luciferasa (por ejemplo, Rluc) se utiliza para la normalización de ensayo (para dar cuenta de la citotoxicidad, las diferencias en el número de células, y la eficiencia de la transfección en el caso de líneas celulares transfectadas transitoriamente) (establos et al. 1999). En este sistema de ensayo de doble luciferasa, la medición de las dos luciferasas es secuencial, lo que requiere etapas de adición de sustrato separados (Figura 2 A), porque las dos luciferasas necesitan diferentes sustratos y recogida de la segunda señal de luminiscencia requiere la terminación de la reacción precedente (Hannah et al. 1998). reactivos de detección comerciales están disponibles para la medición secuencial de Fluc y Rluc, pero también se han descrito formulaciones no comerciales (Dyer et al. 2000). Aunque el ensayo de doble luciferasa Fluc / Rluc es radiométrica por diseño, limitaciones a este sistema deben ser considerados. Para volúmenes de ensayo miniaturizados (& lt; 10 l), el protocolo de adición de dos etapas no es óptima debido a limitaciones de volumen también. Además, como se discute en detalle en la siguiente sección, o bien la enzima luciferasa puede ser inhibida por los compuestos de pequeñas moléculas utilizadas en HTS. En el caso de enzimas dispares, tales como Fluc y Rluc, que son evolutivamente no relacionado y tienen diferentes especificidades de sustrato (Loening et al. 2007), se espera que estas dos enzimas tendrán perfiles de inhibición diferentes. Por lo tanto, los cambios en la relación de luminiscencia Fluc / Rluc destinado a ser el reflejo de modulación objetivo en realidad podría ser el resultado de la inhibición directa y selectiva de cualquiera de enzima indicador de luciferasa. Un ensayo de gen informador de luciferasa de doble alternativa se aprovecha de los mutantes de luciferasa derivados de la CBLuc amarillo-emisor de luz. Las variantes de CBLuc, que comparten una identidad de aminoácidos de más del 95% y catalizan la oxidación del mismo sustrato, D-LH 2. han sido diseñados para emitir ya sea luz verde o roja (Almond et al., 2003 y Wood et al., 1989). El ensayo de luciferasa dual de dos colores requiere una sola adición de sustrato con la actividad de las dos variantes luciferasas diferenciados en función de su longitud de onda de emisión desplazado bioluminiscentes (Figura 2 B). Debido a la alta secuencia de aminoácidos similitud, se espera que los inhibidores de lo más probable afectar tanto CBLucs de manera similar, es decir, una sustancia química que inhibe la actividad enzimática de una CBLuc sería inhibir la otra, así, dando así una ventaja a los dos colores ensayo de luciferasa dual sobre el Fluc / Rluc ensayo doble-luciferasa. Una desventaja del ensayo es la CBLuc, aunque parcial, la superposición espectral de la luz emitida por estas luciferasas. Esto requiere el cálculo de factores de corrección para los espectros de emisión verde y rojo de solapamiento con líneas de células independientes que expresan las variantes individuales CBLuc (Davis et al. 2007). La detección de las luciferasas de escarabajo (Fluc y CBLuc) en ensayos de genes informadores basados ​​en células utilizados en HTS normalmente requiere la lisis celular, y como tal, restringe estos ensayos a una sola medición del punto final de la actividad de luciferasa. El uso de luciferasas que son secretadas de forma natural, tales como gluc (Verhaegent y Christopoulos, 2002) o Cluc (Nakajima et al. 2004), parece ser adecuado para ensayos que podrían beneficiarse de la detección no invasiva de la respuesta reportero en diferentes puntos de tiempo en todo el curso de un experimento (Figura 2 C). Gluc es monomérico, representa la luciferasa más pequeño clonado hasta la fecha (en ~ 20 kDa), y contiene una secuencia señal requerida para la expresión eficaz, la secreción y la actividad de la enzima (Tannous et al. 2005). Aunque gluc produce luminiscencia brillante que Rluc, se descompone muy rápidamente, lo que requiere el uso de lectores a base de inyección (Tannous et al., 2005). Para hacer frente a esto, las variantes gluc se han construido cuya luminiscencia vida media es estable durante varios minutos, aunque la actividad específica de estas variantes es significativamente menor. Sin embargo, la emisión de luz estable parece alcanzable mediante la adición de 0,1% de Triton al sobrenadante obtenido a partir de células secretoras de gluc (Maguire et al., 2009). Estructura y función de los Fluc Fluc es miembro de una superfamilia de enzimas que forman adenilato-, que incluye sintetasas acilo y arilo-CoA reductasa, y péptido sintetasas no ribosomal (Gulick, 2009) y por homología de secuencia primaria, parece estar más estrechamente relacionado con ciertos ligasas acilo-CoA (~ 30% de homología con la planta de 4 cumarato: CoA ligasa) (Baldwin, 1996). Transferencia de un grupo ciclasa a un sustrato para formar una enzima asociada intermedio es, mecánicamente, un modo común de la activación del sustrato en esta familia de enzimas (Conti et al. 1996 y McElroy et al. 1967). Fluc es un hidrolizante de ATP, la descarboxilación de 4-oxidorreductasa que requiere un sustrato de luciferina que contiene la estructura del ácido hidroxi-benzotiazolilo-tiazolina-carboxílico (D-LH 2), ATP, oxígeno, y un catión de metal (por lo general Mg 2+) para producir la luz (Figura 3 Ai) (Marques y Esteves da Silva, 2009). La bioluminiscencia es producido a partir de D-LH 2 por Fluc a través de una reacción de desplazamiento nucleófilo S N 2 en la que el carboxilato en el anillo de tiazolina ataca el resto α-fosforilo de ATP (Figura 3 Ai). El primer paso en los resultados de la reacción en la liberación de i PP y la formación de un luciferilo-ciclasa unido a la enzima, LH 2 - amp (Fraga et al. 2004 y Rhodes y McElroy, 1958). La segunda etapa de la reacción implica la oxidación de LH 2 - amp por el oxígeno molecular. Esto conduce a la producción de un dioxetanone luciferina inestable, que genera CO 2 y un electrónicamente excitado oxiluciferina que, tras la desintegración espontánea al estado fundamental, genera fotones de tanto la luz verde y rojo (Figura 3 Ai) (Inouye, 2010 y Marques y Esteves da Silva, 2009). Figura 3. bioluminiscente y reacciones oscuras catalizada por Fluc (A) La reacción catalizada por la luz Fluc (i). Los sustratos de D-luciferina (D-LH 2) y ATP son utilizados por Fluc para formar un luciferil adenilato-intermedio (LH 2 - amp). Después, este intermedio se somete a ataque nucleofílico por el oxígeno molecular, y al desplazamiento posterior de AMP, se forma un dioxetanone inestable, que a continuación se descompone espontáneamente para formar oxylucifein, y CO 2 con la emisión de un fotón (Marques y Esteves da Silva, 2009) . (Ii) las reacciones catalizadas por oscuros Fluc se muestran en el área sombreada de color gris. Uno de ellos consiste en una reacción secundaria en la que la oxidación de LH 2 - amp se produce para formar el potente inhibidor L-AMP, que puede someterse a la pirofosforolisis o tiolisis para producir inhibidores menos potentes, L o L-CoA reductasa, respectivamente (Fontes et al. 1997). (B) Fluc También se ha reportado el uso de ciertos ácidos grasos como sustratos que producen metabolitos grasos de acil-CoA reductasa. Constantes cinéticas para la síntesis de ácido lineoic-CoA se toman de Oba et al. (2003). (C) La potente inhibición observado para la novela de 3,5-diaryloxadiazole, PTC124, es debido a la explotación de una reacción catalizada por oscuro Fluc en el que PTC124 forma un aducto con AMP a través de su carboxilato m. También se muestra el potencial catalizada Fluc-tiolisis de PTC124-AMP por CoASH para producir un metabolito, PTC124-CoA. Además de catalizar una reacción de emisión de luz, varias reacciones secundarias que no producen luz, llamadas reacciones "oscuras", también son catalizadas por Fluc. Una de estas reacciones oscuro implica la oxidación de LH 2 - amp que resulta en la formación de AMP-deshidro luciferilo (L-AMP), un inhibidor potente Fluc (Figura 3 Aii). L-AMP ha demostrado ser un inhibidor de unión fuerte del sitio activo (Rhodes y McElroy, 1958 y Ribeiro y Esteves da Silva, 2008) (Figura 3 Aii), y se ha documentado que hasta un 20% de la D - LH 2 sustrato se desvía a la formación de este compuesto inhibidor (Fraga et al. 2006). El inhibidor de L-AMP es un ejemplo de un tipo especial de inhibición de la enzima en el que la enzima cataliza la formación de su propio inhibidor. Este tipo de inhibidor se conoce como un inhibidor de aducto multisustrato (MAI), la afinidad de los cuales se puede estimar a partir del producto de la KD s para los dos sustratos (D-LH 2 y ATP) y en el caso de L-AMP, inhibición nanomolar se observa (Figura 3 Aii). Curiosamente, el parpadeo de las luciérnagas como se ve en una noche de verano puede ser atribuido a la reacción de luciferasa productoras de luz interrumpido intermitentemente por inhibición rápida y potente de la reacción bioluminiscente través de la formación de L-AMP (Ghiradella y Schmidt, 2004). La regeneración de la luciferasa activa dentro de la linterna de la luciérnaga se cree que se produce por reacción de L-AMP con pirofosfato y / o CoASH, como ruptura de L-AMP que se ha observado cuando se añaden concentraciones micromolares de estos compuestos para vitro Fluc reacciones en (Fontes et al., 2008 y Fraga et al., 2005) (Figura 3 Aii). menos potentes (m) inhibidores Tanto la pirofosforolisis y tiolisis de rendimiento L-AMP (L o L-CoA reductasa, respectivamente), facilitando así la competencia por el sustrato D-LH 2 y la regeneración de la enzima activa (Marques y Esteves da Silva, 2009) . reactivos de detección Fluc comerciales a menudo contienen CoASH, y la adición de ~ 100 M CoASH a la reacción Fluc convierte la bioluminiscencia de un flash para una respuesta resplandor (Fraga et al. 2005). Fluc catálisis utilizando CoASH como sustrato (Fraga et al. 2005) no es sorprendente teniendo en cuenta que sintetasas Fluc y acil-CoA reductasa pertenecen a la misma superfamilia (Gulick, 2009 y Oba et al. 2003). De hecho, Fluc puede catalizar la formación de ciertos graso acil-CoA (& gt; C 16; Figura 3 B) a partir de sustratos tales como el ácido araquidónico, aunque a un eficiencia catalítica reducida con relación a la reacción de luciferina (Oba et al., 2003). Además, Oba y sus colegas (2009) han sido capaces de convertir una graso acil-CoA sintetasa derivado de un clic escarabajo no luminosa en una enzima luciferasa a través de mutaciones puntuales de residuos del sitio activo (Oba et al. 2009). Estos estudios apoyan la premisa de que Fluc surgió de una ancestral sintetasa acil-CoA. Fluc fue la primera enzima en la superfamilia de enzimas de formación de adenilato-para el cual se determinó la estructura de rayos X (Conti et al., 1996). La estructura apo Fluc consiste en los dominios N-terminal y C-terminal, tanto que contiene α + β estructura, que están unidos por una región de bisagra flexible (Figura 4 A) (Conti et al. 1996). El sitio activo de la enzima se encuentra en el dominio N-terminal cerca de la región bisagra (Conti et al. 1996). Además, se observó por Conti et al. (1996) que la estructura de Fluc tiene un nuevo motivo de unión a ATP (PDB: 1LCI). Figura 4. Estructura del escarabajo luciferasas (A) La estructura apo de Fluc como se determina por Conti et al. (1996) se muestra (PDB: 1LCI) que representa la α secundaria y elementos estructurales beta que comprenden los dominios N - y C-terminales. (B) Superposición de la estructura apo Fluc (cian) con la estructura con destino a DLSA de LcrLuc (oro; 2D1S AP). El cierre de la hendidura entre los extremos N y dominios C-terminales se observa en la estructura con destino a DLSA. El sitio activo reside en el dominio N-terminal cerca de la hendidura. Una de las estructuras más informativos para examinar el papel de residuos del sitio activo es la estructura resolución co-cristal de 1,3 Å para la luciferasa de luciérnaga de Luciola cruciata (LcrLuc) unido a un análogo de la luciferil adenilato-intermedio (5'-O - [ dehydroluciferyl) sulfamoil] adenosina; DLSA; AP: 2D1S) (Nakatsu et al 2006).. La estructura de la DLSA unido a luciferasa de escarabajo confirma el papel de muchos de los residuos invariantes en Fluc (identificado por Conti et al. 1996) que están involucrados con la unión del sustrato, por ejemplo, Asp424 de LcrLuc forma enlaces de H a la ribosa anillo de ATP (Figura 5 A). También se encuentra en el sitio activo de LcrLuc es un péptido de nueve residuo que contiene una secuencia de firma para esta superfamilia de enzimas, con residuos invariantes Gly202 y Lys208 anclaje de los extremos de este péptido. Una tercera motivo se encuentra a la línea del sitio activo y contiene el Glu346 residuo invariante de LcrLuc. Esta estructura confirma que el sitio activo de la enzima está revestido por tres regiones identificadas originalmente por Conti et al. (1996). Figura 5. Estructuras de luciferasa de escarabajo Inhibidor-Bound (A) El LcrLuc: estructura con destino a DLSA se muestra y los tres motivos conservados, propuesto originalmente por Conti et al. (1996) como candidatos probables del sitio activo se muestran en cian. Varios residuos invariantes que bordean el sitio activo se resaltan (numeración de residuos basado en LcrLuc). (B) Superposición de la LcrLuc: estructura DLSA, unidos a la Fluc: PTC124-AMP obligado complejo inhibidor. LcrLuc: DLSA (proteína en oro; ligando en verde), el PTC124-AMP (proteína de púrpura; ligando en amarillo). motivos conservados se muestran de nuevo en cian. Las interacciones y conformaciones de ambos ligandos y regiones de proteínas invariantes están altamente conservados entre las dos estructuras. La comparación de la apo Fluc (Conti et al., 1996) y LcrLuc: (. Nakatsu et al 2006) estructuras con destino a DLSA sugieren que un cambio conformacional se produce tras la unión del sustrato, en el que una gran hendidura entre las cierra N - y C-terminales dominios (Figura 4 B). El cierre de esta hendidura se cree que aumenta la eficacia catalítica, tal vez por la exclusión de agua, lo que impediría la extinción de la excitado oxiluciferina producto (Conti et al. 1996 y Nakatsu et al. 2006). Recientemente, los biosensores robustos para ensayos de HTS se han desarrollado utilizando un enfoque que se aprovecha de esta conformacionales reporteros permutados circularmente cambio (Fan et al., 2008). Estos reporteros se han utilizado en ensayos para detectar cAMP (y otros analitos celulares), así como la actividad intracelular de la proteasa (split luciferasas también se han usado como sensores intramoleculares) (Tabla S1) (Binkowski et al. 2009 y Fan et al. 2008). Definición de Fluc Inhibidor Quimiotipos través de una cuantificación de HTS (qHTS) Para entender mejor la naturaleza y frecuencia de la inhibición Fluc por moléculas pequeñas, hemos perfilado una parte de la bibliotecas moleculares de moléculas pequeñas Repositorio de 72 K (MLSMR; PubChem Ensayo de Identificación [AID] 411) para la actividad Fluc (en un ensayo que utiliza una detección comercial reactivo formulado para medir los niveles de ATP; Auld et al 2008a).. A través de la detección en múltiples concentraciones del compuesto (qHTS) (Inglese et al., 2006), los valores de potencia y la eficacia se derivaron para cada compuesto en esta biblioteca representativa. De los qHTS Fluc, se encontró que aproximadamente el 3% de los compuestos de esta pantalla inhibida Fluc. (IC 50 ≤ 10 M), bien dentro de los intervalos de concentración de cribado típico, se observó una inhibición potente para 0,9% de la biblioteca. serie química principal asociada con la inhibición Fluc incluido imita del sustrato D-LH 2, como benztiazoles, bencimidazoles y benzoxazoles, así como serie química que están desprovistos de una estructura similar obvio a ATP o D-LH 2 sustratos, tales como los oxadiazoles 3,5-diaril (Figura 6 A). Los experimentos adicionales confirmaron que muchos de los compuestos de tipo benzotiazol eran competitivos con D-LH 2 (véase la Figura 6 B, por ejemplo). Figura 6. Tipos y comportamiento de los inhibidores de la luciferasa de luciérnaga (A) Distribución de Potencia (PAC 50) para cuatro quimiotipo prominentes han encontrado para inhibir Fluc de los esfuerzos de perfiles. Mostrados son benztiazoles (i), bencimidazoles (ii), benzoxazoles (III) y 3,5-diaril-oxadiazoles (iv). (B) Comparación de Fluc y luciferasa Ultra-Glo contra un inhibidor de luciferasa 2-phenylbenzothiazole en múltiples concentraciones de sustrato. Los gráficos de variación ATP (principal) o D-LH 2 variación (recuadro) se muestran y se variaron a las 0,25, 2, 25, y 250 mM, lo que resulta en cuatro conjuntos de CRC. En cada caso, el sustrato constante estuvo presente en 250 mM. Los datos Fluc se muestran como círculos sólidos, y de los datos de la luciferasa Ultra-Glo se muestran como círculos abiertos. benztiazoles simples parecen ser puramente competitiva con D-LH 2, ya sea para la luciferasa como se ve desde el desplazamiento a la derecha de los CRCs (disminución de potencia). (C) Diferencia en la distribución de potencia entre los inhibidores identificados en una formulación comercial de Fluc (PK-Light) y una formulación comercial de Ultra-Glo (KinaseGlo), que ilustra cómo la fuente de reactivo de luciferasa puede afectar vitro interferencia en el ensayo en. (D) Comparación de Fluc y Glo Ultra-luciferasa potencias de inhibición para los análogos de quinolina ensayó usando niveles K M de sustratos. CRC para quinolinas i (cuadrados) y II (círculos) se muestran para Fluc (formas sólidas y líneas de puntos) y la luciferasa Ultra-Glo (formas abiertas y las líneas sólidas). La selectividad entre las dos luciferasas se observa para tales quinolinas. Figuras adaptados de Auld et al. 2008a y Auld et al. 2009b. Las barras de error corresponden a la desviación estándar de la media. Este trabajo de perfilado también destacó dos variables clave a considerar cuando se examina la actividad de la biblioteca contra-Fluc la fuente de la luciferasa y la formulación de reactivos sustrato utilizado (K M concentraciones de sustratos frente a un exceso de sustratos típicos de reactivos de detección). Por ejemplo, los reactivos utilizados basados ​​en luciferasa de detección (TiterGlo célula o formatos de ensayo bioquímicos basados ​​en sustratos pro-luciferina, tales como P450 Glo) de Promega Corporation contienen el P. pennsylvanica variante luciferasa Ultra-Glo. Nuestro trabajo de perfiles indica que Ultra-Glo es menos probable que ser inhibida por los compuestos utilizados en el cribado (Auld et al. 2009b). Además, aunque muchos de los mismos quimiotipos se encontraron para inhibir ambas luciferasas, estos compuestos fueron significativamente menos potente frente a una formulación de Ultra-Glo (PubChem AID: 1379; Figura 6 C). Un ejemplo de esto se ilustra por la actividad de una serie de compuestos de quinolina, lo que demuestra la inhibición en los qHTS Fluc pero sólo fueron débilmente activos contra purificada luciferasa Ultra-Glo (Figura 6 D). El andamio quinolina / quinazolina también se encuentra entre los inhibidores de la proteína quinasa competitivos con ATP conocidos. Sin embargo, consistente con la única característica de plegado de unión a ATP de Fluc, no se han encontrado los compuestos específicos para inhibir proteínas quinasas (Auld et al. 2008a). Curiosamente, un ensayo de qHTS para la proteína quinasa CLK4 construido para detectar el agotamiento de ATP o la producción de ADP a cabo contra una biblioteca de compuestos centrado quinasa (quinazolina / pirimidina) usando una formulación de Ultra-Glo mostró una potente inhibición de CLK4, pero no se identificaron inhibidores de luciferasa (PubChem AID: 1379) (Tanega et al., 2009). Otra consideración importante cuando se realiza una counterscreen / perfil para los compuestos que pueden inhibir Fluc es la formulación de reactivo de detección. Si uno quiere identificar inhibidores competitivos incluso débilmente, es necesario para determinar la actividad de Fluc en presencia de las concentraciones de K M de sustratos. Perfiles de actividad Fluc en presencia de reactivos de detección, que contienen exceso de sustratos Fluc (además de CoASH coenzima), no puede identificar inhibidores competitivos débilmente. Sin embargo, si uno se refiere únicamente a la identificación de falsos positivos (inhibidores Fluc) en el ensayo específicos, reactivos de detección idénticos a los utilizados en el ensayo se pueden utilizar, siempre que la concentración de la enzima Fluc en los ensayos es muy similar. Adicionalmente, la dilución de los reactivos de detección Fluc disponibles en el mercado para ahorrar coste puede resultar en la detección de más inhibidores de Fluc (en relación con los reactivos de detección sin diluir), como la concentración de sustratos Fluc es menor, permitiendo de este modo la inhibición por inhibidores de Fluc menos potentes. Efectos de la luciferasa inhibidores en ensayos a base de células Actividad de Fluc en ensayos basados ​​en células puede ser confundida por los compuestos que inhiben la enzima Fluc, haciendo evidente la inhibición (Bakhtiarova et al. 2006), o en contra de la intuición, un aumento de la luminiscencia. Se ha encontrado que la proteína Fluc es sensible al fenómeno de estabilización basado en el ligando por compuestos inhibidores, que conduce a la estabilización de proteínas y la acumulación de la proteína afectada (Thompson et al. 1991). Este fenómeno se ha observado para muchas proteínas y recientemente ha sido descrito como un método para identificar dianas proteicas de compuestos (Lomenick et al. 2009). Thompson et al. (1991) fueron los primeros en notar que el tratamiento de Fluc-expresión de células de mamífero con inhibidores de benzotiazol simples dado lugar a un aumento de los niveles de proteína reportera en un transcriptional - y de manera traslacional independiente, resultando en un aumento en contra de la intuición señal de luciferasa después de la detección. Como resultado, la estabilización intracelular de Fluc por compuestos inhibidores es a la vez un fenómeno general y frecuente en ensayos basados ​​en células. El uso de la RAE deriva del perfil de la Fluc MLSMR descrito anteriormente, se realizó un análisis retrospectivo de los experimentos HTS disponibles dentro PubChem de ensayos basados ​​en células que utilizan Fluc como el reportero (Auld et al. 2008b). (2010). & Gt; Conclusión referencias 2003 DJ. C. P. J. Med. Proc. Acad. C. P. J. Med. 2010 DJ. Maloney. et al. Proc. Acad. S. J. Biochem. Biophys. Res. Commun. A. Estructura. 2009 Curr. Opin. Biotechnol. DJ. Metab drogas. 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